La costruzione della Chiesa iniziò nel 1543, grazie al patrocinio di Guidobaldo II che incaricò Girolamo Genga di erigere un tempio monumentale. Genga presiedette alla direzione dei lavori fino alla morte (1551), data in cui subentrò il figlio Bartolomeo. La facciata è divisa in due sezioni: nella parte inferiore sono presenti tre archi, nella parte superiore una “serliana”. L’esterno è privo degli apparati decorativi in travertino ipotizzati nel progetto; l'interno è a croce latina con ampio presbiterio ottagonale. Di interesse i dipinti degli altari: “Le stimmate di San Francesco” ripresa dal dipinto di F.Barocci; “San Carlo Borromeo” del Pandolfi; “L’annunciazione” di G.B.Clarici da Urbino. Nella chiesa è un monumento funebre dedicato a Giulio Perticari di Luigi Mainoni. Tra il 1861 e la prima guerra mondiale la chiesa e il convento vennero destinati ad uso militare. I religiosi riuscirono a ottenere la riapertura al culto nel 1926 e la restituzione del chiostro nel 1975.